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A. DNA模板:
· 盡量使用高質(zhì)量、純化后的DNA作為模板
· 需要提高保真度時,可使用較高的DNA模板濃度并減少循環(huán)數(shù)
· 模板用量:以50 μl反應(yīng)體系為例——
人基因組DNA:0.1~1.0 μg
大腸桿菌基因組DNA:10~100 ng
Lambda DNA:0.5~5 ng
質(zhì)粒或病毒DNA:0.1~10 ng
B. 引物設(shè)計原則:
· 引物長度要滿足特異性需要,一般可在18~25個堿基之間;擴(kuò)增長片段時在24~30個堿基之間;
· 當(dāng)引入克隆位點(diǎn)時,引物末端應(yīng)額外增加3個以上堿基;
· (G+C)%含量應(yīng)盡量控制在40~60%,兩條引物的(G+C)%含量應(yīng)盡量接近;
· 引物中GC堿基分布均勻;
· 盡量避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)三次以上,3’端應(yīng)避免使用A或T;
· 避免引物內(nèi)部自身配對形成二級結(jié)構(gòu);
· 正反向引物之間應(yīng)避免配對堿基,尤其是3’端的三個堿基,否則易生成引物二聚體(Primer dimer);
· 兩條引物的解鏈溫度(Tm)值應(yīng)在42~65℃之間,而且兩條引物間相差不超過5℃;
· 引物Tm值的計算方法:
20 nt以下:Tm = 2℃ x (A + T) + 4℃ x (G + C)
20 nt以上:Tm = 81.5 + 0.41 x (GC%) -600/nt (nt:引物的堿基數(shù))
· 引物用量:
· 0.1~1.0 μM,通??梢?.2 μM起始,根據(jù)體系不同調(diào)整用量;
· 使用簡并引物、隨機(jī)引物時,需增加引物總量以彌補(bǔ)產(chǎn)量損失;但隨著引物量加大,特異性將降低;
· 模板較大較多,或結(jié)構(gòu)較復(fù)雜(如人基因組DNA)時,需減少引物用量以提高特異性;
· 模板較小較少(如質(zhì)粒模板)時,增加引物用量可提高產(chǎn)量。
C. 核苷酸(dNTPs):
· 常規(guī)dNTPs濃度為每種核苷酸0.1~1.0 mM,通??梢?.2 mM起始,根據(jù)體系不同調(diào)整用量;
· 低濃度(0.05~0.1 mM)可增加保真性,但會降低產(chǎn)量;
· 高濃度提高產(chǎn)量,尤其是長片段PCR,但會降低保真度。
D. 鎂離子濃度
· 對于Taq DNA聚合酶,鎂離子的*濃度為1.5~2.0 mM;
· *濃度取決于模板、緩沖液、DNA和dNTPs(每一種都有可能鰲合鎂離子);
· 鎂離子濃度過低,會降低產(chǎn)量;
· 鎂離子濃度過高,會增加非特異性PCR產(chǎn)物;
· 優(yōu)化鎂離子濃度時,通常以0.5 mM梯度遞增,zui高到4 mM。
E. Taq DNA 聚合酶濃度
· 推薦使用濃度為 1~2.5 U/50 μl反應(yīng)體系。
F. 起始反應(yīng)
· 在冰上配制反應(yīng)體系;
· zui后加聚合酶;
· 將熱循環(huán)儀預(yù)熱至變性溫度(94℃)后,放入PCR管,立即進(jìn)行反應(yīng)。
G. 變性溫度與時間
· 通常于94℃初始變性,使DNA雙鏈*打開;
· 變性時間通常為15~30秒;
· 避免長時間或高溫度孵育;
· 高GC含量模板可提高變性溫度至98℃。
H. 退火溫度與時間
· 通常情況下,退火溫度為引物Tm值減5℃,在55~60℃之間;
· 提高退火溫度有利于減少非特異性條帶;
· 常規(guī)退火時間為15~30秒。
I. 延伸溫度與時間
· 延伸反應(yīng)通常在72℃下進(jìn)行。
· Taq酶的延伸時間大約為15~30秒/kb DNA;
· 產(chǎn)物小于1 kb時,建議延伸時間為30~60秒;
· 產(chǎn)物大于3 kb或反應(yīng)超過30個循環(huán)時,可能需要更長的延伸時間。
典型的循環(huán)條件:
預(yù)變形94℃ 2 分鐘
94℃ 30秒,
55℃ 30秒,
72℃ 1分鐘/1 kb,25~30個循環(huán)
72℃ 5分鐘
注:上述反應(yīng)條件適用于普通Taq DNA聚合酶催化的PCR反應(yīng)。當(dāng)DNA模板富含GC、具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)、低濃度或產(chǎn)物>5 kb時可能需要改變相應(yīng)條件。
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