實驗原理

帶電荷的蛋白質，在電場中向著與其所帶電荷電性相反的電極泳動稱為電泳。血清中各種蛋白質的等電點不同，但大都在pH7以下，若將血清置于pH8.6的緩沖液中，則這些蛋白質均帶負電，在電場中都向陽極移動。由于各種蛋白質在同一pH環(huán)境中所帶負電荷多少及分子大小不同，所以在電場中向陽極泳動速度也不同。蛋白質分子小而帶電荷多者，泳動速度快;反之，則泳動速度慢。因此可將血清蛋白質依次分為清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白和g球蛋白五條區(qū)帶，經染色可計算出各血清蛋白質含量的百分數。

以醋酸纖維薄膜(CAM)為支持介質，電泳分離后經染色處理，可展示出清晰的蛋白質電泳圖譜。由于染色時染料與蛋白質的結合與蛋白質的量成正比，因此將各蛋白質帶剪下，分別用一定量的NaOH稀溶液洗脫下來，即可進行比色，測定出各蛋白質區(qū)帶的相對含量。也可用一定量的有機溶劑使CAM溶解制成透明膜而用光密度計進行掃描定量。

醋酸纖維薄膜電泳具有微量、快速、簡便及分辨率較高等優(yōu)點，廣泛應用于血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、同工酶的分離和測定。

實驗試劑

1.巴比妥—巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，m=0.06)。稱取巴比妥2.21克和巴比妥鈉12.36克，溶于500毫升蒸餾水中，加熱溶解。待冷至室溫后，再加蒸餾水稀釋至1000毫升。

2.染色液

(1)麗春紅S染色液：稱取麗春紅S O.4g、三氯醋酸6g，用蒸溜水溶解并稀釋至100ml。

(2)氨基黑10B染色液：稱取氨基黑(C22H13O12N6S3Na3)10B 0.1g,溶于20ml無水乙醇中，加冰醋酸5ml,使其溶解。另取磺基水楊酸2.5g，溶于少量的蒸餾水中，加入前液將兩液混合搖勻，再以蒸餾水補足至100ml。稱取麗春紅S0.4克及三氯醋酸6克;用蒸餾水溶解，并稀釋至100毫升。

3.漂洗液。

(1)3%(V/V)醋酸溶液：適用于麗春紅S染色的漂洗。

(2)甲醇45ml、冰醋酸5ml、蒸餾水50ml混勻，適用于氨基黑10B染色的漂洗。

4.透明液 取無水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混勻備用。

5. 洗脫液

(1)0.1mol/L NaOH溶液：用于麗春紅S染色的洗脫。

(2)0.4mol/L NaOH溶液：用于氨基黑10B染色的洗脫。

6.40%(V/V)醋酸溶液。

實驗設備 電泳儀、電泳槽、分光光度計或光密度儀。

實驗材料 醋酸纖維薄膜、培養(yǎng)皿、濾紙、鑷子、點樣器、直尺、鉛筆、剪刀等。

實驗步驟

1、電泳槽的準備

將巴比妥-巴比妥鈉緩沖液加入電泳槽中(兩側槽內注入等量的緩沖液)，調節(jié)兩側內的緩沖液，使其在同一水平面，液面與支架的距離約為2～2.5cm。支架寬度到恰好適合CAM的長度，用3～4層濾紙或4層紗布搭橋。

2、CAM準備

取醋纖薄膜(2厘米*8厘米)在CAM的無光澤面(涂有醋酸纖維素)距一端1.5cm處用直尺和鉛筆輕劃一線(與CAM的長軸垂直)，作點樣標記，將膜條編號后將無光澤面朝下浸入巴比妥-巴比妥鈉緩沖液中，待充分浸透后取出(一般約需求20～30min)，夾于潔凈的濾紙中,吸去多余的緩沖液.

3、點樣

用血清加樣器將3-5ul無溶血的新鮮血清均勻地點在劃線處，樣品應與膜的邊緣保持一定距離，以免電泳圖譜中的蛋白區(qū)帶變形。待血清滲入膜后移開點樣器。點樣應注意，要適量、均勻和垂直，并避免弄破薄膜。

4、平衡

將已點樣的薄膜加樣面朝下，點樣端置于陰，將膜條緊貼于電泳槽支架的鹽橋上并保持平直，橋的另一端垂入緩沖液中，鹽橋將膜的兩端與緩沖液連通，加上槽蓋平衡5min后通電電泳。

5、電泳

正確聯(lián)接電泳槽與整流器對應的正負極，點樣側接負極，另一側接正極。開啟電源通電。調節(jié)電壓10V～15V/cm膜長,電流0.4～0.6mA/cm膜總寬，電泳40-60分鐘(通常夏季需45min,冬季需60min)，待電泳區(qū)帶展開3.5cm～4cm時即可關閉電源。

6、染色

通電完畢，立即取出薄膜直接浸入麗春紅S或氨基黑10B染色液中，染色5～10分鐘。

7、漂洗

至少準備3～4個漂洗皿，裝入漂洗液。從染色液中取出薄膜條并盡量瀝去染色液，按順序投入漂洗液中反復漂洗，直至背景漂白為止。此時清晰可見5條色帶。待干。

8、定量

(1)洗脫比色法 取六支試管，分別標明“A、α1、α2、β、γ、空白"。將漂洗凈的薄膜剪下各區(qū)帶放入相應的試管內，另從空白背景剪一塊平均大小的膜條置于空白管中，根據染色不同按以下方法洗脫。

①氨基黑10B染色洗脫：6支試管于清蛋白管內加入0.4mmol/L NaOH溶液6ml,其余5管各加3ml，振搖數次，置37℃水浴20分鐘，使色澤*浸出。用620nm波長，以空白管調零，讀取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。

②麗春紅S染色洗脫：洗脫液用0.1mmol/L氫氧化鈉溶液，加入量同上。10分鐘后，于清蛋白管內加入40%(V/V)醋酸0.6ml，其余5管各加入0.3ml，以中和部分氫氧化鈉，使溶液色澤加深。如出現(xiàn)沉淀，可離心取上清液比色。用520nm波長，以空白管調零，讀取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。

(2)光密度掃描法

① 透明：將已漂凈吹干的CAM條浸入透明液中3～5分鐘，取出平鋪于潔凈干燥玻片上(應無氣泡)，直立片刻除去過多的透明液。于90～100℃烘箱內烘烤5～10分鐘，取出冷卻至室溫。此法透明的CAM，各蛋白區(qū)帶鮮明，薄膜平整，可直接掃描或作*保存。若用十萘氫或液體石醋透明，應將漂洗過的薄膜烘干后進行透明，透吸后的薄膜不能久藏，易發(fā)生皺折。

② 掃描定量：將已透明的薄膜放入全自動光密度計或其它光密度掃描的光路，選擇波長520nm，描記各蛋白區(qū)帶峰，并計算各蛋白成分的相對含量。

9、計算

定量計算時，先計算各光密度值的總和：再計算血清各部分蛋白質所占的百分率

吸光度總和(T)=2A+α1+α2+β+γ(吸光度)

血清各蛋白組分的相對百分數=Ax/AT×100%

Ax表示各球蛋白組分 (2A+α1+α2+β+γ)的吸光度。

A%=2A/ T×100% β=β/ T×100%

α1%=α1/ T×100% γ%=γ/ T×100% α2%=α2/ T×100%

各組分蛋白質含量(g/L)=(各組分蛋白百分數(%)×血清總蛋白g/L)/100

10、臨床意義

(1)血清蛋白醋纖薄膜電泳的正常參考值為：

蛋白質組分 g/L 占總蛋白百分比(%)

白蛋白 35～52 57.0～68.0

α1球蛋白 1.0～4.0 1.0～5.7

α2球蛋白 4.0～8.0 4.9～11.2

β球蛋白 5.0～10.0 7.0～13.0

γ球蛋白 6.0～13.0 9.8～18.2

(2)臨床意義

電泳圖譜可為臨床疾病診斷提供依據。

腎病型可見于急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭等，圖型表現(xiàn)為Alb降低，α2和β升高;肝硬化型可見于慢性活動性肝炎、肝硬變等，圖型表現(xiàn)為Alb降低，β和γ增高，可出現(xiàn)β與γ難以分離而連接在一起的“β-γ"橋，此現(xiàn)象是由于肝臟纖維增生導致IgA增高所致;急性反應時相型常以α1、α2增高為特征;慢性炎癥型則以Alb降低，α2、γ增高較為常見;M蛋白血癥主要見于多發(fā)性骨髓瘤，病人有大量單克隆蛋白質(主要是IgG或IgA)，電泳時可在β和βγ之間出現(xiàn)一條峰形狹窄的區(qū)帶，稱M區(qū)帶。

注意事項

1.通電時，不得接觸槽內的緩沖液或CAM，以防觸電。

2.每次電泳時應交換電極以使兩側電泳槽內緩沖液的正負離子相互交換，以使緩沖液的PH維持在一定水平。

3.電泳緩沖液的液面要保持一定的高度，過低可能會出現(xiàn)γ球蛋白的電滲現(xiàn)象(γ球蛋白向陰極移動)，同時電泳槽兩側的液面應保持在同一水平，否則，通過薄膜時有虹吸現(xiàn)象，將會影響蛋白質分子的泳動速度。

4.電泳失敗或圖譜不理想的常見原因

(1)電泳圖譜不整齊或蛋白各組分分不佳：點樣過多;點樣不均勻、不整齊;薄膜過濕，樣品擴散;點樣速度太慢，薄膜表面局部干燥或薄膜未*浸透或溫度過高致使膜面局部干燥或水分蒸發(fā);緩沖液變質;電泳時薄膜放置不正，歪斜、彎曲，與電流方向不平行;樣品不新鮮;電流過低;CAM質量不好，薄膜結構過分細密，透水性差，導電差等。

(2)染色后白蛋白中間著色淺：染色時間不夠或染色液陳舊;白蛋白含量過高，可減少血清用量或延長染色時間。

(3)電泳速度慢：電流過低;供給薄膜的緩沖液不足，連接薄膜與緩沖液的濾紙或紗布過薄;溫度過低;薄膜結構過分細密，透水性差，導電差;緩沖液水分蒸發(fā)，致使離子強度增大。

(4)薄膜透明不*：透明液陳舊;浸泡時間不足;烘箱溫度未到90℃即把薄膜放入。

5.染料問題：各種染料對血清各組分有不同的親和力，大多數染料對白蛋白的親和力大于球蛋白。如氨基黑10B對球蛋白的結合力為白蛋白的80%，因此常導致白蛋白結果偏高，球蛋白偏低。用麗春紅S染色，效果優(yōu)于氨基黑10B。麗紅是一種指示劑，PH<10時呈紅色，PH>12.5時呈紫色。在酸性溶液中它的zui大吸收峰在523nm左右，呈對稱性。在血清蛋白正常濃度范圍內，麗春紅S能與各蛋白質組分成正比例結合，而氨基黑10B則對白蛋白染色過深，區(qū)帶中容易出現(xiàn)著色不全的小點，不夠理想。

6.樣品要求點在粗糙面(無光澤面)，否則樣品很難吸入膜內。電泳時將點有樣品的一面朝下，以防電泳過程中水分蒸發(fā)，影響電泳結果。

7.標本應新鮮，不得溶血。溶血標本會使β球蛋白假性升高，因血紅蛋白電泳位置在β球蛋白區(qū)域內。